Takato

مرکز تحقیقات کاربردی و تولید بذر (تکاتو)

 

قبل از شروع استخراج وسایل و بافرهای موردنیاز از قبل آماده‌ شده و در صورت لزوم در اتوکلاو استریل شدند. مراحل این روش به شرح ذیل می­باشد.

  1. قبل از شروع كار بافر استخراج CetylTerimetilAmoniomBromide) CTAB)را در دماي 65 درجه سانتي­گراد به مدت نيم ساعت در بن­ماري قرار داده كه هدف از انجام اين كار حل شدن مجدد نمك ها و يكنواخت شدن محلول مي­ باشد.
  2. 5/0 گرم بافت تازه را در هاون چینی سرد ریخته و به همراه ازت مایع کاملا پودر کرده و به تیوب منتقل می­شود.
  3. مقدار 800 میکرولیتر بافراستخراج (جدول) و 24 میکرولیتر مرکاپتواتانول(β–Mercaptoethanol) (به ازای هر 100 میکرولیتر بافر استخراج، 3 میکرولیتر مرکاپتو ) به هرکدام از تیوب­های حاوی نمونه اضافه شده و به آرامی تکان داده شد تا بافر به تمام نمونه رسیده و لیز شدن اولیه انجام گیرد. مرکاپتواتانول یک آنتی اکسیدانت (احیاکننده) بوده که محافظت از گروه­های تیول آنزیم­ ها در مقابل اکسیداسیون را بر عهده دارد و قبل از استفاده به بافر استخراج اضافه می­شود. به علت سمی و بدبو بودن بهتر است اضافه کردن مرکاپتواتانول به نمونه زیر هود انجام گیرد. ترکیب بافر استخراج با نمونه منجر به تجزیه غشاء سلولی و همچنین مانع فعالیت نوکلئازها می ­شود.
  4. به مدت نيم ساعت نمونه­ ها در داخل بن­ ماري در دماي 65 درجه سانتيگراد قرار داده شده و هر 5 دقيقه يك بار آن ها را تكان داده كه هدف از انجام این کار بالا بردن كارايي بافر است.
  5. هم حجم نمونه (800 میکرولیتر) ايزوآميل الكل:كلروفرم به هر نمونه اضافه كرده و چندين بار تيوپ ­ها (ویال­ ها) به آرامي سر و ته شد. نسبت اين محلول 24:1 است یعنی در 100 سی­سی آن مقدار 96 سی­سی کلروفرم و 4 سی­سی ایزوآمیل الکل وجود دارد. به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت که در همین حین نمونه ­ها به آرامی تکان داده شده تا کل مواد با هم مخلوط شوند.
  6. نمونه­ ها به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق ( 24 درجه) در دور 13000 سانتريفوژ شده. پس از عمل سانتریفوژ سه لایه در تیوب تشکیل می­ شود: فاز آبی (Aqueous Phase) ، فاز میانی (Inter Phase) و فاز آلی(Organic Phase) . فاز آبی حاوی مولکول های محلول در آب به انضمام اسیدهای نوکلوئیک می­ باشد. پروتئین ها و لیپیدها در فاز آلی قرار گرفته و مواد زائد گیاهی غیرقابل حل نیز در فاز میانی، بین این دو لایه گیر می­ افتند و از هم جدا می­ شوند. از سه لایه تشکیل شده در تیوب­ ها محتویات لایه رویی را با سمپلر (با سرسمپلر کات-تیب)، به آرامی و با دقت بالا بدون آنكه نوك تيوپ با ناخالصي­ ها تماس داشته باشد به میزانی که مقدور باشد(حدود 600-500 میکرولیتر) برداشته و به ویال جدیدی منتقل گردید. لازم به ذکر است که برای دسترسی به DNA با خلوص بالا مرحله کلروفورم:ایزوآمیل­الکل دو بار تکرار گردیده، در دور دوم محتویات لایه رویی به میزان 400-300 میکرولیتر برداشته می­ شود.
  7. جهت رسوب DNA به اندازه دو سوم (3/2) نمونه (250 تا 350 میکرولیتر) ايزوپروپانول سرد به آن اضافه شده، در اين مرحله با چند بار تكان دادن تيوپ، ميتوان كلاف DNA را مشاهده نمود و سپس به مدت نيم ساعت نمونه ­ها را در فريزر 20- درجه سانتی­گراد قرار داده و هر 5 دقيقه يك بار آنها را به آرامي سر و ته كرده، اين مرحله را ميتوان تا 16 ساعت در يخچال نگهداري نمود.
  8. برای رسوب و تشکیل پلت (Pellet) از فاز آبی نمونه­ ها به مدت 10 دقيقه در دماي 4 درجه سانتيگراد و دور 13000 سانتريفوژ شده، در پايان اين مرحله DNA ژنومي در ته تيوپ رسوب نمود.
  9. محتويات تيوپ را خالي كرده و به هر نمونه 500 ميكروليتر الكل اتانول 80 درصد اضافه شده و به آرامي آن ها را سر و ته كرده، به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد و دور 8000 سانتریفیوژ شده، محتويات تيوپ را خارج نموده و آن ها به مدت 30 دقیقه بر روي كاغذ صافي يا دستمال كاغذي وارونه قرار داده تا الکل آن خارج شود.
  10. برای استفاده از DNA در مراحل بعدی ارزیابی ژنوتیپی و جهت حل شدن پلیت DNA ، مقدار 100-50 میکرولیتر بافر TE(یک مولار Tris، نیم مولار EDTA)  و یا آب تزریقی به هر تیوب اضافه شد و به مدت 24 الی 48 ساعت در دماي اتاق نگهداري كرده، سپس به داخل یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد منتقل شد.

جدول تهیه بافر CTAB

اجزای بافر

استخراج

غلظت در بافر

استخراج

غلظت محلول

پایه

مقدار برداشته‌شده برای

تهیه 100 میلی‌لیتر بافر

Tris

100 میلی مولار

1 مولار

10 میلی­لیتر

EDTA

150 میلی مولار

5/0 مولار

30 میلی­لیتر

NaCl

2100 میلی مولار

5 مولار

42 میلی­لیتر

CTAB

2 درصد

-

2 گرم

BME

140 میلی مولار

14 مولار

1 میلی‌لیتر

آب مقطر

-

-

17 میلی‌لیتر