Takato

مرکز تحقیقات کاربردی و تولید بذر (تکاتو)

 

تکنیک SDS-PAGE یک روش کم هزینه، سریع و تکرارپذیر جهت مطالعه اولیه پروتئین‏ ها می‏ باشد. معمولا از این روش برای بررسی مراحل خالص‏ سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئین‏ ها بکار می‏رود. اساس این روش تفکیک پروتئین‏ ها بر اساس وزن مولکولی است. در تکنیک SDS-PAGE به دلیل استفاده از ماده سدیم دودسیل سولفات (SDS) و ژل پلی‏ اکریل آمید ، قدرت تفکیک پروتئین ‏ها مناسب می ‏باشد. SDS شوینده‏ای آنیونی است

که با اتصال به نواحی هیدروفوب پروتئین ‏ها، آنها را دناتوره می ‏کند. مولکول SDS با اتصال به پروتئین‏ ها، بار طبیعی آن ها را می ‏پوشاند و توزیع یکنواختی از بارهای منفی روی آن ایجاد می‏ نماید. در نتیجه جداسازی پروتئین ‏ها تنها بر اساس وزن مولکولی صورت می‏گیرد. جهت خطی نمودن مولکول ‏های پروتئینی و از بین بردن باندهای دی‏سولفید، آنها را به مدت پنج دقیقه در محلول SDS و حرارت 95 درجه سانتی‏گراد قرار می‏دهند. در این هنگام با بارگذاری پروتئین‏ ها در الکتروفورز، جداسازی آنها تنها بر اساس وزن مولکولی صورت می‏پذیرد. پروتئین ‏ها دارای چهار ساختار متفاوت می‏ باشند که واحدهای سازنده همه آنها، اسیدهای آمینه هستند. واحد اندازه ‏گیری پروتئین، دالتون می‎‏باشد.

در روش SDS-PAGE برای ارزیابی پروتئین از الکتروفورز عمودی استفاده می‏ گردد. اساس الکتروفورز، ایجاد میدان الکتریکی است. از انواع ژل می‏توان به Starch، آگارز و پلی‏اکریل‏آمید اشاره نمود که در روش SDS-PAGE از ژل پلی ‏اکریل ‏آمید استفاده می ‏شود.

ژل پلی‏ اکریل ‏آمید از دو جز اصلی شامل اکریل (C3H5NO) و بیس ‏اکریل (C7H10N2O2) تشکیل شده است. پلی‏اکریل‏آمید به دو روش Native-PAGE و Denatured-PAGE ساخته می ‏شود. در روش Native-PAGE از SDS در هیچ‏یک از مراحل استفاده نشده و ساختار دوم پروتئین حفظ می ‏شود ولی در Denatured-PAGE از SDS در تهیه بافر و ژل استفاده شده و در نتیجه ساختار دوم پروتئین توسط SDS شکسته می ‏شود.

روش Denatured-PAGE همان روش SDS-PAGE است. در این روش با افزودن SDS و گرما دادن، پروتئین‏ ها ساختارهای دوم و سوم خود را از دست داده و به‏صورت خطی درمی‏آیند و بدین ترتیب بر اساس وزن و اندازه از هم جدا می‏ شوند. پروتئین در این حالت دارای بار منفی شده و در نتیجه در الکتروفورز به سمت قطب مثبت بسته به اندازه و وزن مولکولی در درون ژل حرکت کرده و از یکدیگر تفکیک می‏ شوند.

در روش SDS-PAGE، ژل اکریل ‏آمید از دو بخش ژل بالا (Stacking gel) و ژل پائین (Seprating gel) تشکیل می‏ شود (شکل 1). غلظت اکریل ‏آمید این دو ژل متفاوت بوده و در ژل پائین غلیظ‏ تر است، بنابراین در ژل بالا که غلظت آن کم است (معمولا 5 درصد)، پروتئین‏ ها فقط به شکل خطی درآمده و مرتب می ‏شوند تا در ژل پائین با غلظت بیشتر از هم تفکیک شوند. درصد ژل بالا و پائین متغیر بوده و به اندازه پروتئین موردنظر بستگی دارد، هر مقدار وزن مولکولی پروتئین مورد بررسی بزرگ‏تر باشد می ‏بایست ژل با درصد کمتر تهیه شود.

اجزای تشکیل‏ دهنده ژل اکریل ‏آمید شامل آب ‏مقطر (که خلوص آن بسیار مهم است)، مخلوط اکریل و بیس‏ اکریل (معمولا با نسبت 30 درصد)، تریس 5/1 مولار (Tris, pH 8.8)، SDS 10 درصد، آمونیوم پرسولفات (APS) 10 درصد و TEMED می‏ باشد. در تهیه ژل باید توجه نمود که APS و TEMED باید در آخرین به سایر مواد اضافه شوند، زیرا به سرعت سبب پلیمره (سفت) شدن ژل خواهند شد. برای خروج گازها و جلوگیری از تشکیل حباب در ژل، می‏ بایست از پمپ خلا استفاده نمود.

ابتدا باید ژل پائین تهیه و به کاست منتقل گردد. برای یکنواخت شدن سطح ژل و کاهش تماس آن با هوا، روی ژل می‏توان مقدار کمی ایزوپروپانول افزود و پس از پلیمره شدن ژل، آن را تخلیه نمود. سپس ژل بالا تهیه شده و به داخل کاست و روی ژل پائین افزوده و شانه در محل آن جایگذاری می‏ شود. پس از تهیه ژل پلی‏اکریل‏آمید و بافر و خارج کردن شانه از روی ژل، کاست حاوی ژل به داخل تانک منتقل و بافر به داخل تانک افزوده می ‏گردد. در این مرحله نمونه‏ های پروتئین بارگذاری می‏ شوند. ولتاژ دستگاه الکتروفورز برای ژل بالا باید کم و در حدود 50 ولت با شدت جریان حدود 20-18 میلی ‏آمپر تنظیم شود، زیرا همان‏طور که پیش‏تر گفته شد، در ژل بالا قطعات پروتئین می ‏بایست به آرامی به شکل خطی درآیند تا در ژل پائین از هم تفکیک شوند. با رسیدن قطعات پروتئین به ژل پائین (با دای قابل تشخیص است)، ولتاژ دستگاه را می‏توان تا 120-100 ولت افزایش داد.

یکی از روش‏ های رنگ ‏آمیزی ژل استفاده از کوماسی‏بلو (Coomassie blue) است (جدول 1). پس از اتمام مرحله الکتروفورز، ژل با احتیاط خارج و به مدت 20-15 دقیقه در محلول کوماسی‏بلو غوطه ‏ور می‏ گردد. سپس ژل را از محلول کوماسی‏بلو خارج و برای رنگ‏ بری، به مدت 60-45 دقیقه در محلول دی‏استین (Diacetin) قرار می‏گیرد (جدول 2). با پایان این مرحله، ژل آماده ارزیابی و تفسیر نتایج خواهد بود (شکل 2).

جدول 1. مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه کوماسی‏بلو

ماده

مقدار

متانول

400 میلی‏لیتر

کوماسی‏بلو

1 گرم

اسید استیک

100 میلی‏لیتر

آب مقطر

500 میلی‏لیتر

 

جدول 2. مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه دی‏استین

ماده

مقدار

متانول

200 میلی‏لیتر

اسید استیک

100 میلی‏لیتر

آب مقطر

700 میلی‏لیتر